DAP-seq助力揭示SlWRKY14調控番茄果色和品質的新機制

2025年10月1日，浙江大學農業與生物技術學院汪俏梅教授課題組在Cell Reports（IF: 6.9）上在線發表了題為SlWRKY14 integrates carotenoid and flavonoid biosynthetic pathways to regulate coloration and quality of tomato fruits的研究論文，該研究借助DAP-seq技術揭示番茄中的WRKY轉錄因子SlWRKY14通過“轉錄激活+表觀抑制"雙重機制整合類胡蘿卜素與類黃酮兩大代謝途徑，為番茄果實品質改良提供了新靶點與理論依據。藍景科信為該研究提供了DAP-seq技術支持。

文章主要內容

研究背景

在園藝作物研究領域，番茄因其經濟價值與科研模型地位，始終是學者關注的焦點。果實的色澤與營養品質，更是育種工作的核心目標。果實著色與營養品質的形成主要依賴于類胡蘿卜素（如番茄紅素和β-胡蘿卜素）和類黃酮（如柚皮素查爾酮）等次生代謝產物的積累。但現代育種因長期追求產量和耐儲運性，導致果實中類胡蘿卜素、類黃酮含量顯著下降。現有研究已明確兩類物質的合成通路，但二者協同調控機制未知。

主要研究結果

核心發現一：SlWRKY14直接調控番茄果實色澤與代謝物積累

1. 定位候選基因SlWRKY14

此前，為解析番茄類胡蘿卜素生物合成的轉錄調控網絡，作者以SlPSY1（類胡蘿卜素合成關鍵酶）啟動子為誘餌進行了酵母單雜交（Y1H）篩選。該篩選鑒定出了SlWRKY14（基因編號Solyc12g006170），這是一種I類WRKY轉錄因子。并檢測了SlWRKY14在三個代表性番茄品種中的表達水平。結果發現，SlWRKY14均在果實破色期（B期）表達量相對較高，并在果實成熟過程中持續維持高表達水平。

2. SlWRKY14功能驗證

作者通過構建SlWRKY14 敲除株系（KO）和過表達（OE）株系，測定不同成熟階段果實的表型、色素含量及產量相關指標，結果顯示SlWRKY14 敲除株系果實呈更深紅色，類胡蘿卜素含量顯著升高、柚皮素查爾酮含量降低；過表達株系果實呈橙黃色，類胡蘿卜素含量降低、柚皮素查爾酮含量升高；KO與OE株系的果實成熟啟動時間（花期到轉色期天數）、乙烯釋放峰值、單果重及單株總產量，與WT無顯著差異；上述結果表明，SlWRKY14調控果實著色且不影響果實成熟進程。

圖1 SlWRKY14調控番茄果實著色，且該過程不依賴于果實成熟進程

核心發現二：SlWRKY14通過“SlWRKY14-SlHDA1模塊"表觀抑制類胡蘿卜素合成

1.SlWRKY14下游調控分子機制探究

為研究SlWRKY14轉錄調控機制，作者通過DAP-seq鑒定出SlWRKY14在基因組中的7536富集峰，對應3329個靶基因，其中有609個為啟動子相關基因，并鑒定到典型的W-box motif。進一步GO和KEGG分析顯示這些基因顯著富集于色素代謝相關通路，其中包含類胡蘿卜素和類黃酮生物合成的關鍵步驟。聯合RNA-seq結果發現類胡蘿卜素合成基因（SlDXS1、SlPSY1等）顯著下調，類黃酮合成基因（SlPALA、Sl4CL等）顯著上調。 SlWRKY14可能通過調控MEP途徑與苯丙烷途徑之間的代謝流，實現對果實色素代謝的精準調控。進一步ChIP-qPCR（體內）、EMSA（體外）、酵母單雜交（Y1H）、雙熒光素酶報告實驗證實，SlWRKY14直接結合SlDXS1、SlPSY1啟動子并抑制其表達。

圖2 SlWRKY14調控類胡蘿卜素與類黃酮之間的代謝流

圖3 通過DAP-seq和RNA-seq在全基因組鑒定SlWRKY14的結合位點

圖4 SlWRKY14直接結合SlDXS1的啟動子區域以抑制其表達

圖5 SlWRKY14直接結合SlPSY1的啟動子區域以抑制其表達

2.探究SlWRKY14對類胡蘿卜素生物合成碳流的轉錄抑制機制

為探究SlWRKY14介導轉錄抑制的機制，作者以SlWRKY14為誘餌，對通過靶向Y2H實驗，檢測了SlWRKY14與所有已知SlHDA（組蛋白去乙酰化酶）家族蛋白的相互作用，結果顯示，僅SlHDA1能與SlWRKY14發生特異性相互作用，并通過Y2H、Pull-down、Co-IP、LCI證實該結論。隨后通過構建SlHDA1-RNAi株系發現SlHDA1作為SlWRKY14的共抑制因子，參與調控類胡蘿卜素合成相關基因的表達。通過檢測SlWRKY14敲除株系與SlWRKY14 過表達株系果實的整體組蛋白乙酰化水平、組蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性、組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理、ChIP等一系列實驗進一步證實，SlWRKY14通過招募組蛋白去乙酰化酶SlHDA1，去除組蛋白在H3K9和H3K27位置上的乙酰基，以降低組蛋白乙酰化水平并增加染色質的緊縮狀態，從而抑制SlDXS1和SlPSY1的表達和類胡蘿卜素的積累，且該表觀抑制不影響SlPALA的激活過程。

圖6 SlWRKY14與SlHDA1存在物理相互作用

圖7 組蛋白去乙酰化酶的功能性活性是SlWRKY14-SlHDA1復合物抑制類胡蘿卜素生物合成基因轉錄所必需

核心發現三：SlWRKY14激活類黃銅生物合成通路

類黃酮是番茄果實果皮中的主要色素，由SlPAL、SlCHS、SlCHI、SlF3H等酶催化合成，DAP-seq結果顯示，類黃酮合成途徑中的SlPALA是SlWRKY14直接調控的靶基因，并通過ChIP-qpcr、EMSA、雙熒光素酶實驗證實SlWRKY14結合類黃酮合成關鍵基因SlPALA啟動子W-box并激活其轉錄。與抑制類胡蘿卜素合成不同，SlWRKY14激活SlPALA無需SlHDA1參與，且未檢測到與組蛋白乙酰轉移酶（HAT）互作，推測通過未知共激活因子調控。OE株系中SlPALA表達量提升3倍，下游類黃酮合成基因（Sl4CL、SlC4H、SlCHS）同步上調，最終推動類黃酮積累。

圖8 SlWRKY14既是類黃酮生物合成的激活因子，也是類胡蘿卜素生物合成的抑制因子

小結

綜上所述，該研究揭示了SlWRKY14在番茄果色和品質形成中的關鍵作用。一方面通過直接激活類黃酮途徑基因SlPALA，增強類黃酮的積累，另一方面形成SlWRKY14-SlHDA1調控模塊表觀抑制類胡蘿卜素途徑基因SlDXS1、SlPSY1，從而抑制類胡蘿卜素的合成，實現番茄果色的兩條代謝通路差異化調控。為番茄果實顏色及營養品質改良提供了新靶點，具有重要育種應用前景。

圖9 SlWRKY14調控番茄果色和品質形成的分子機制