三大技術(shù)如何聯(lián)手揭開PAC1腫瘤免疫的神秘面紗？

在醫(yī)學(xué)研究前沿，腫瘤免疫治療是備受矚目的“主戰(zhàn)場"。科研人員努力尋找新靶點和治療新機制，卻困難重重。腫瘤微環(huán)境抑制T細(xì)胞功能，讓宿主抗腫瘤防線脆弱。T細(xì)胞功能障礙的真相不明，現(xiàn)有免疫治療手段難以治愈腫瘤。此時，尋找T細(xì)胞特異性抑制途徑成為破局關(guān)鍵。而CUT&Tag、ATAC-seq和ChIP-seq這三大技術(shù)，宛如三把“神兵利器"，在這場與腫瘤的較量中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

經(jīng)典文獻(xiàn)解讀

2020年1月，在《Nature Immunology》發(fā)表的題為“The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity"的研究論文，揭示了磷酸酶PAC1在腫瘤免疫中的作用及其分子機制。研究團隊借助CUT&Tag、ATAC-seq和ChIP-seq等技術(shù)，證實了PAC1通過招募NuRD復(fù)合體，重塑T細(xì)胞染色質(zhì)開放性，抑制下游效應(yīng)基因表達(dá)，促使T細(xì)胞耗竭，削弱宿主抗腫瘤免疫力。此項研究將PAC1明確為腫瘤免疫治療的潛在靶點，為開發(fā)新型腫瘤免疫療法提供了關(guān)鍵理論依據(jù)。

? 下面我們通過一個簡單的技術(shù)路線圖，來看看他們是如何做的：

研究結(jié)果

TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示，PAC1在TILs中特異性高表達(dá)，高PAC1表達(dá)預(yù)示不良預(yù)后。為了評估PAC1在T細(xì)胞激活中的作用，在Jurkat T細(xì)胞系中過表達(dá)不同類型的PAC1以及利用PAC1基因敲除小鼠進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，PAC1以不依賴磷酸酶的方式抑制T細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能。

圖1. PAC1在耗竭的TIL中選擇性上調(diào)，抑制T細(xì)胞反應(yīng)。

圖E1. PAC1與癌癥中的抑制性受體相關(guān)。

圖E2. PAC1減輕T細(xì)胞反應(yīng)。

作者進(jìn)一步研究了PAC1在T細(xì)胞反應(yīng)中的抑制作用是否影響宿主的抗腫瘤免疫。野生型和PAC1敲除的小鼠經(jīng)AOM-DSS 誘導(dǎo)獲得結(jié)腸炎相關(guān)癌癥模型，評估腫瘤數(shù)量、大小及組織學(xué)分級；雜交獲得MMTV-PyMT模型，觀察自發(fā)性乳腺癌生長及TILs浸潤；皮下接種 B16-F10細(xì)胞獲得黑色素瘤模型，檢測腫瘤生長曲線及肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量。結(jié)果顯示，PAC1敲除的小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量減少60%，乳腺癌體積縮小50%，肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量降低40%；腫瘤組織中 CD3? T細(xì)胞浸潤增加，PD-1等抑制性受體表達(dá)降低。以上結(jié)果表明，PAC1抑制宿主對癌癥的免疫反應(yīng)。

圖2. PAC1通過抑制免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

圖E3. PAC1抑制宿主抗腫瘤免疫。

腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)PAC1，與T細(xì)胞激活時PAC1的短暫誘導(dǎo)不同。作者推測腫瘤微環(huán)境成分參與其調(diào)控，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能維持激活T細(xì)胞中PAC1高表達(dá)，結(jié)腸癌患者腫瘤間質(zhì)液中ROS水平上升，LCMV Cl13慢性感染也會使PAC1持續(xù)上調(diào)。通過LUC報告基因?qū)嶒灒l(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激通過激活EGR1，結(jié)合PAC1啟動子特定區(qū)域維持其高表達(dá)。隨后，評估了PAC1在氧化應(yīng)激下T細(xì)胞反應(yīng)中的作用。用LCMV Cl13感染野生型和PAC1敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)敲除的小鼠體重恢復(fù)快、病毒載量低，CD8⁺T細(xì)胞數(shù)量和功能更好，抑制性受體表達(dá)低。感染早期免疫反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，敲除PAC1的小鼠T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子能力增強，CTL溶細(xì)胞功能提升。RNA-seq分析顯示，PAC1敲除的CD8⁺T細(xì)胞中效應(yīng)功能和抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因上調(diào)。以上結(jié)果表明，炎癥早期PAC1上調(diào)會抑制T細(xì)胞抗氧化和效應(yīng)功能，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。

圖3. 氧化應(yīng)激通過誘導(dǎo)EGR1維持PAC1的表達(dá)。

圖4. PAC1對ROS介導(dǎo)的T細(xì)胞功能障礙至關(guān)重要。

圖E4. PAC1對ROS介導(dǎo)的T細(xì)胞功能障礙至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，PAC1在染色質(zhì)上的積累對其抑制免疫功能至關(guān)重要。為進(jìn)一步了解PAC1對染色質(zhì)可及性的影響及其作用機制，作者首先通過IP-MS分析發(fā)現(xiàn)，PAC1與NuRD復(fù)合物存在關(guān)聯(lián)，并且這種相互作用的發(fā)生依賴于PAC1的C端結(jié)構(gòu)域，而與PAC1的催化活性并無關(guān)聯(lián)。隨后，在Jurkat細(xì)胞中使用HDAC抑制劑進(jìn)行處理，結(jié)果顯示該抑制劑能夠有效緩解PAC1所介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制現(xiàn)象。同時，借助CUT&Tag技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)PAC1缺失時，會導(dǎo)致CHD4（作為NuRD復(fù)合物的核心組成成分）與T細(xì)胞效應(yīng)功能相關(guān)基因位點之間的結(jié)合能力減弱。通過ChIP-seq分析，進(jìn)一步揭示PAC1能夠?qū)M蛋白H3和H4的乙酰化過程以及H3K36的甲基化過程產(chǎn)生抑制作用。另外，ATAC-seq分析結(jié)果表明，敲除PAC1 會顯著增加與T細(xì)胞效應(yīng)功能相關(guān)基因的染色質(zhì)可及性，并且這些基因還與記憶T細(xì)胞的發(fā)育過程密切相關(guān)。以上結(jié)果表明，增強的PAC1招募NuRD復(fù)合物來改變?nèi)旧|(zhì)的可及性。

圖5. PAC1在染色質(zhì)上積累依賴于它的N端。

圖E5. PAC1與NuRD復(fù)合物相互作用并調(diào)節(jié)染色質(zhì)可及性。

圖6. PAC1在T細(xì)胞活化過程中招募NuRD復(fù)合物重塑染色質(zhì)可及性。

綜上所述，PAC1通過招募NuRD復(fù)合物重塑效應(yīng)T細(xì)胞的表觀遺傳程序，抑制T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。在炎癥條件下，激活的T細(xì)胞通過ROS - EGR1信號通路表達(dá)高水平的PAC1，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭和宿主抗腫瘤免疫減弱。

圖E6. PAC1在ROS介導(dǎo)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞功能障礙中的作用模型。