對基因轉錄和翻譯的精準調控可以定義細胞的特殊形態和功能。利用單細胞轉錄組測序技術鑒定差異表達基因，在轉錄水平揭示細胞多樣性調控機制研究已有很多報道，但是翻譯水平的調控機制對細胞類型影響仍有待闡明。在本文中，作者以果蠅為研究模型，聚焦于頭部的神經元細胞與神經膠質細胞。這兩類細胞都由同一種神經干細胞分化而來，神經元細胞的主要功能是突觸和電信號傳導，而神經膠質細胞的作用是形成血腦屏障并充當免疫細胞。盡管兩類細胞類型不同，它們的轉錄組卻具有一定的相似性。
作者分析了RNA-seq和Ribo-seq數據，發現轉錄水平與核糖體足跡的數量并不總是匹配的（R2 = 0.664），說明轉錄后調控對于基因表達也有著重要影響。例如，分別編碼控制鉀離子通道的Shaker(sh)和海藻糖水解酶Trehalase(Treh)在轉錄水平上相似，但核糖體足跡結果顯示Treh具有更高的翻譯效率（TE），這些結果表明翻譯調控在果蠅頭部神經細胞的基因表達中占有重要地位。
圖1. 果蠅頭部轉錄組和翻譯組數據比較分析
以上結果只能證明翻譯調控對不同基因的作用，無法精確到具體細胞類型。作者進一步通過Gal4/UAS系統和nSyb/UAS系統表達RpL3表位標簽標記的神經元細胞和神經膠質細胞，并提取免疫純化標記后的核糖體和相關mRNA的復合體，最后成功獲得了果蠅頭部神經元細胞和神經膠質細胞的翻譯組數據。神經元和神經膠質細胞中分別有10821和10994個基因上發現核糖體足跡，已知的標記基因被富集，而非靶標記被消耗完。KEGG結果顯示與細胞類型已知功能相應的核糖體足跡有更好的富集。
作者同時對FLAG-tag純化的核糖體-RNA復合體中的RNA進行測序，聯合Ribo-seq結果對兩種細胞類型在不同通路上富集程度進行了比較。許多具有功能特征的神經元基因，如離子通道、G蛋白偶聯受體、神經肽和視覺感知蛋白在神經膠質中顯示出很低的TE。與轉錄水平相比，這些基因在翻譯水平上，神經元和神經膠質細胞之間的差異很大。在全基因組維度上，與RNA-seq相比，Ribo-seq數據在不同細胞類型的相關性更低（R2= 0.59 vs. 0.81）總之，這些數據表明翻譯調節對塑造細胞類型特異性蛋白表達的實質性貢獻。
圖2. 細胞類型特異性Ribo-seq和RNA-seq揭示不同翻譯調控機制
作者通過對差異翻譯轉錄本（DTT）上核糖體足跡的分布進行分析，發現在神經膠質細胞中DTT的翻譯受到抑制，核糖體足跡顯著偏向5’端非翻譯區（5’-UTR），并且這種模式在全基因組中并不多見。作者推測：神經膠質細胞通過5’-端uORFs的翻譯來抑制下游ORF的翻譯。此外，根據對5’-UTR與CDS序列上的密碼子的足跡累計得分進行統計，發現AUG及其同源密碼子在5’-UTR上有較高的積累而在CDS中任何密碼子都沒有顯著的積累，并且與神經元功能相關的轉錄本通常含有長5’-UTR和上游AUG富集。因此，作者認為神經膠質細胞是通過uORF將核糖體停滯在5’-UTR上，從而抑制神經元相關轉錄本的翻譯。
圖3. 在神經膠質細胞中，核糖體在差異翻譯轉錄本(DTTs)的5 '端阻滯
圖4. 神經膠質中AUG上游的足跡積累
這種抑制能否引起細胞類型差異？作者選擇Rh·1（視紫紅質1蛋白）作為重點研究對象。發現Rh·1的主動翻譯幾乎只能在神經元中，并且在神經膠質細胞中Rh·1的轉錄本上核糖體足跡偏向5’-UTR區域。作者隨后構建了轉基因報告菌株，發現膠質細胞中Rh·1的蛋白水平顯著低，且與報告菌株相比，轉錄后差異更為顯著。結果說明神經膠質細胞通過uUTR區域選擇性抑制神經元基因的蛋白質合成，從而增強神經元與神經膠質細胞翻譯組的差異。
圖5. 轉基因Rh1-Venus報告基因揭示了神經細胞和膠質細胞的翻譯差異
通過對果蠅大腦中兩種神經細胞的RNA-seq和Ribo-seq分析，作者發現了大量的轉錄后調控現象，這些現象放大了細胞類型的差異。例如，部分基礎蛋白質（在多種細胞類型均能表達）離子通道和神經遞質受體等在神經膠質細胞中翻譯效率較低，而在神經元細胞中的翻譯效率較高。在神經膠質細胞的mRNA中，核糖體足跡分布顯著偏向于5’-UTR，結合報告基因實驗結果作者推斷uUTR對神經膠質細胞的部分翻譯過程進行了選擇性抑制。這些發現為了解細胞類型多樣性的調控的分子機制提供了新的見解。
核糖體印記測序（Ribosome profile sequencing, Ribo-seq）技術能夠捕獲正在翻譯過程中與核糖體所結合的RNA片段，這些片段的長度一般接近30· nt。通過對這部分RNA片段進行高通量測序可以精確定位核糖體在翻譯過程中的位置，并提供蛋白質合成動態的信息。將Ribo-seq與RNA-seq測序數據進行聯合分析，可以揭示特定基因在轉錄和翻譯層面上調控差異及這些調控對基因表達的影響。
Ribo-seq的基礎分析
ORF在基因組上的分布統計與分類
三堿基節律分析
翻譯基因統計與表達量分析
樣本關系分析
樣本關系分析
組間差異翻譯基因分析
差異翻譯基因的GO和KEGG功能富集分析
Ribo-seq還可與RNA-seq進行聯合分析
翻譯效率（TE）計算
Ribo-seq與RNA-seq的相關性分析
翻譯效率與轉錄水平的關聯分析
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