文章分享：應用Ribo-seq技術量化tRNA對乳腺癌細胞轉移的調控

技術簡介

Ribo-seq，又稱為Ribosome Profiling或者翻譯組測序，能夠對與核糖體結合并正在被翻譯的約30 nt的mRNA片段進行測序，詳細檢測體內的翻譯狀態，Ribo-seq是連接轉錄組學與蛋白質組學之間的橋梁。該技術可構建癌細胞全基因組水平上蛋白翻譯圖譜，量化蛋白質翻譯效率，為基因表達轉錄后調控研究提供支持。

2016年發表在Cell上的“Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression"文章，發現了轉移性乳腺癌細胞中表達上調的特異性tRNA，這些tRNA通過增強富含同源密碼子的轉錄本的穩定性和翻譯來驅動癌細胞轉移。這篇文章主要通過三個關鍵證據支持研究者的觀點：

l  特異性tRNA（tRNA^Glu_UUC和tRNA^Arg_CCG）在高轉移性乳腺癌細胞中表達上調。

l  tRNAs促進了富含其同源密碼子的轉錄本的穩定性和翻譯。

l  tRNA^Glu_UUC通過直接上調EXOSC2和增強GRIPAP1來驅動轉移。

在之前的研究中，科學家發現編碼序列中存在特異性密碼子偏好，影響了蛋白質的表達水平。另一方面，在不同物種中，tRNA含量與蛋白質合成時密碼子使用偏倚相關，并調節基因的表達。這些研究將細胞通路激活與tRNA含量聯系起來。這篇文章的研究目的是通過對比非致瘤細胞系和乳腺癌細胞系中tRNA豐度，揭示tRNA的調節效應以及在腫瘤進程中發揮的作用。

研究者首先對不同細胞系（非致瘤上皮細胞系MCF10a，低轉移乳腺癌細胞系MDA-231和CN34，以及相對應的高轉移亞系MDA-LM2和CN-LM1a）的tRNA進行測序和定量，發現兩組低轉移乳腺癌細胞為獲得更高的轉移能力而選擇相似的tRNA豐度調節模式，并證實了特異性tRNA（tRNA^Arg_CCG和tRNA^Glu_UUC）在高轉移性乳腺癌細胞中表達上調，驗證了tRNAs表達上調后癌細胞轉移和侵襲能力增加（但與細胞增殖能力無關），進一步支持了tRNA水平調節可以特異性促進癌細胞轉移的觀點。

研究使用Ribo-seq技術分別對對照組（Control）、tRNA^Arg_CCG過表達組（tRNA^Arg-OE）和tRNA^Glu_UUC過表達組（tRNA^Glu-OE）細胞系進行分析（Ingolia et al., 2014），檢測活躍核糖體翻譯組的調控結果，用于評估tRNA上調對轉錄后調控過程的影響。通過這些數據，科學家觀察到了普遍存在的核糖體保護片段（RPFs，ribosome protected fragments）的周期性和長度（Figures 4A, 4B, S4B, and S4C）。在過表達細胞系中，一些基因的相對核糖體占有率較高，這些基因的編碼序列中富含與特異性tRNA配對的同源密碼子（Figures 4C and S4D）。根據上述結果，測量了約4000個蛋白質的表達水平直接評估tRNA調節對蛋白質表達的影響。在過表達細胞系中，與特異性tRNA同源的密碼子含量較高的轉錄本普遍穩定。

Figure 4. Post-Transcriptional Consequences of tRNA^Glu_UUC and tRNA^Arg_CCG Upregulation

Figure S4. tRNA^Glu_UUC and tRNA^Arg_CCG Overexpression Alters Ribosomal Occupancy and Translational Landscapes, Related to Figure 4

該研究分析了全基因組數據并重點關注了tRNA^Glu_UUC過表達細胞系的核糖體譜數據，確定了當tRNA^Glu_UUC豐度更高時，EXOSC2和GRIPAP1是潛在靶點。這些基因在高轉移細胞中高表達，但轉錄水平上無顯著上調，表明這些基因上調主要是由轉錄后調節。

利用Ribo-seq技術分析核糖體保護片段（RPF），將tRNA偏好、核糖體占用和蛋白質表達之間相關聯。為了量化tRNA含量的變化對活躍核糖體翻譯組和蛋白質表達的影響，研究者定義了一個tRNA偏好評分參數，并對轉移不良親本細胞系（MDA-par和CN34-per）及其高轉移衍生系（MDA-LM2和CN34-LM1a）進行了分析。核糖體保護片段（RPF）被歸一化為每個細胞系的總RNA（TT），用于解釋基因表達的差異。親本與衍生系之間的RPF/TT比率在生物學重復中保持一致，顯著正相關（Figures 7A and S7A）。將每個基因的tRNA偏好評分與其各自矯正的核糖體足跡重疊后，發現具有較高tRNA偏好評分的轉錄本在那些受核糖體結合較多的轉錄本中強烈富集（Figure 7B）。研究者隨后將每個基因轉錄本豐度進行歸一化處理，證實了高轉移亞系中，tRNA偏好得分高的基因顯著富集（Figure 7C）。以上結果表明，差異tRNA表達為蛋白質翻譯圖譜的改變提供重要信息。

Figure 7. tRNA Preference Scores Were Informative of Differential Ribosome Occupancy and Protein Expression

Figure S7. Differential Protein Expression and tRNA Preference Scores, Related to Figure 7

這項研究證實了tRNA豐度的改變可以調節細胞中蛋白的表達，并且癌細胞可以通過調節tRNA水平來調整癌癥進程中的多數啟動子的表達。雖然文章中這種tRNA分析方法是基于乳腺癌細胞系研究，但研究者認為在其他疾病、模型和物種中還有更廣闊的應用前景。

小結

Ribo-seq技術檢測到核糖體結合的轉錄本與tRNA表達顯著相關，將基因表達調控中的轉錄過程與翻譯過程關聯起來，可以通過檢測mRNA核糖體保護片段（RPF），識別翻譯過程中的tRNA調控事件。Ribo-seq技術可以與DAP-seq/ChIP-seq、RNA-seq、tRNA-seq和質譜等技術一起，將基因表達的調控過程完整呈現出來。

引用文獻

Goodarzi H, Nguyen HCB, Zhang S, Dill BD, Molina H, Tavazoie SF. Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression. Cell. 2016. 165(6):1416-1427.