DAP-seq技術(shù)在bHLH-zip轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靈芝代謝研究中的應(yīng)用

靈芝酸（GAs）是一種三萜類化合物，是靈芝屬中的關(guān)鍵藥理活性化合物，具有多種生物學(xué)功能。然而，直接調(diào)控GA生物合成的轉(zhuǎn)錄因子仍然知之甚少。

該研究首先采用Illumina和PacBio測(cè)序策略對(duì)靈芝菌株的基因組進(jìn)行了從頭測(cè)序和組裝，隨后進(jìn)行了基因功能分析，并注釋了參與三萜類化合物和麥角甾醇生物合成的基因。然后，通過多個(gè)物種的基因保守性比對(duì)分析，篩選到了調(diào)控三萜生物合成的潛在bHLH-zip轉(zhuǎn)錄因子甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）。

圖1. 在全基因組水平上鑒定SREBP的結(jié)合位點(diǎn)和基序

通過DAP-seq分析，在全基因組水平鑒定了轉(zhuǎn)錄因子SREBP的結(jié)合位點(diǎn)和靶基因。進(jìn)一步對(duì)這些靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)包括三萜類化合物合成和脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑富集。電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）進(jìn)一步驗(yàn)證了SREBP與靶基因之間的相互作用。

圖2. RNA-seq分析顯示了SREBP調(diào)控靈芝三萜類、麥角甾醇和脂質(zhì)生物合成基因的表達(dá)

通過RNA-seq與DAP-seq聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)SREBP靶基因之中，參與類固醇和三萜類生物合成的甲羥戊酸激酶（g3941）和3-羥基-3-甲基戊二酰合成酶（g1941），以及參與麥角甾醇生物合成的甾醇異構(gòu)酶（ERG2，g7787）和羊毛甾醇14-脫甲基酶（ERG11，g3908），在SREBP過表達(dá)菌株（OEP::SREBP）中顯著上調(diào)表達(dá)。此外，參與甘油磷脂/甘油脂代謝的3個(gè)靶基因，乙醇胺-磷酸轉(zhuǎn)移酶（g1208）、溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶（g4309）和心磷脂特異性磷脂酶（g4280）也顯著上調(diào)表達(dá)。次級(jí)代謝組學(xué)和脂質(zhì)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，甲羥戊酸、羊毛甾醇、麥角甾醇和13種不同的GA以及多種脂質(zhì)的含量在該SREBP過表達(dá)菌株中顯著增加。此外，當(dāng)OE::SREBP菌株用外源性SREBP特異性抑制劑fatostatin處理時(shí)，SREBP過表達(dá)對(duì)三萜類化合物和脂質(zhì)代謝的影響得以恢復(fù)。以上RNA-seq、次級(jí)代謝組學(xué)和脂質(zhì)代謝組學(xué)的分析，揭示了SREBP的過表達(dá)通過促進(jìn)GA、麥角甾醇和脂質(zhì)生物合成相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致GA、麥角甾醇和脂質(zhì)代謝顯著增加。

圖3. SREBP調(diào)節(jié)靈芝GA、麥角甾醇和脂質(zhì)生物合成的機(jī)制圖

總之，該研究在靈芝基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)bHLH-zip轉(zhuǎn)錄因子SREBP。DAP-seq鑒定了DNA序列5′-GRVGRVGRVGR-3′為最佳的SREBP結(jié)合基序，以及參與GA、麥角甾醇和脂質(zhì)生物合成的關(guān)鍵靶基因。SREBP過表達(dá)菌株的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究闡明了SREBP在靈芝三萜類化合物和脂質(zhì)代謝中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

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